Jest to jeden z najstarszych Kościołów w Wilnie, o którym po raz pierwszy wspomniano w historycznych źródłach w 1320 r., kiedy to Książę Wielki Litewski Giedymin zaprosił rzemieślników i kupców z chrześcijańskiej Europy do Wilna. W 1323 r. w liście do Franciszkanów pisał, że w Wilnie zbudowano dla nich Kościół. To, że Kościół wiązał się z przybyciem kupców do miasta, świadczy tradycyjnie przyznawany w Europie Centralnej tytuł św. biskupa Mikołaja z Miry – patrona podróżników, kupców, rzemieślników, więźniów, dzieci.

Kościół został ufundowany w latach 1382-1387, ze środków wileńskiego namiestnika Wielkiego Księstwa Litewskiego J. Jaunisa (Janulisa). O okresie budowy świątyni świadczą archaiczne formy architektury wczesnego gotyku. Kościół rekonstruowano i odnawiano kilkakrotnie, dlatego we wnętrzu (na sklepieniu, w ołtarzach) znajdują się wyraźnie formy późnego gotyku z początku XVI w. i połowy XVIII w.

Wdzięczne filary, na których wspierają się gwiaździste sklepienia dzielą Kościół na trzy nawy. W ołtarzu wielkim – Ukrzyżowany Chrystus. W lewym ołtarzu czczony jest obraz św. Mikołaja. W prawym ołtarzu – obraz Matki Boskiej Bolesnej wyrzeźbiony z drewna, malowany i zasłonięty złoconymi płytami.

W latach 1901-1939 Kościół św. Mikołaja był jedynym Kościołem w Wilnie, w którym odbywały się nabożeństwa w języku litewskim, dlatego otrzymał miano zarzewia kultury litewskiej. W 1930 r. dzięki staraniom Litwinów z Wilna, w Kościele postawiono pomnik na pamiątkę 500. rocznicy śmierci Witolda Wielkiego. W latach powojennych, po zamknięciu Wileńskiej Bazyliki Archikatedralnej, Kościół pełnił funkcję prokatedry, a w 1959 r. obok Kościoła wzniesiono rzeźbę św. Krzysztofa patrona Wilna, wykonaną przez rzeźbiarza Antoniego Kmielauskasa. Był to akt ruchu oporu, gdyż reżim komunistyczny zabronił używania herbu miasta, na którym widnieje tenże święty.