W Sanktuarium Miłosierdzia Bożego czczony jest pierwszy Obraz Jezusa Miłosiernego namalowany w Wilnie. Obraz namalował malarz Eugeniusz Kazimirowski w 1935 r. w Wilnie w oparciu o wizję św. Faustyny. Podczas objawienia Pan Jezus tak mówił siostrze Faustynie: „Obiecuję, że dusza, która czcić będzie ten obraz, nie zginie. Obiecuję także, już tu na ziemi, zwycięstwo nad nieprzyjaciółmi, a szczególnie w godzinę śmierci. Ja sam bronić ją będę jako swej chwały.”

Podczas wizyty na Litwie św. Jan Paweł II modlił się przed tym Obrazem, który wtedy jeszcze znajdował się w Kościele Świętego Ducha. Zwracając się do wiernych papież zachęcał, aby bez względu na wszystko starać się być dziećmi Ojca Niebieskiego, poświęcającymi się uczniami Słowa Wcielonego i posłusznymi narzędziami Ducha Świętego: „Takim narzędziem Boga była św. Faustyna, która uwierzyła w słowa objawionego jej Zbawiciela i wypełniła jego wolę, aby namalować obraz niosący ludziom pocieszenie i spokój”.

W obecnym miejscu Sanktuarium Miłosierdzia Bożego, w XV-XVI w. znajdował się pierwszy Kościół p.w. Trójcy Przenajświętszej. W XVIII w. Kościół przebudowano, należał do Uniwersytetu Wileńskiego. W 1821 r. władze carskie zamieniły świątynię w Cerkiew Objawienia Pańskiego, a w 1920 r. znowu przypadła katolikom. W latach 1946-1947 w Kościele pracował spowiednik św. Faustyny bł. M. Sopoćko. Po II wojnie światowej władze sowieckie zamknęły Kościół. 8 marca 2004 r. kardynał Audrys Juozas Bačkis podpisał dekret o założeniu Sanktuarium Miłosierdzia Bożego, a Obraz Jezusa Miłosiernego wyeksponowano w sąsiedztwie Kościoła Ducha Świętego w głównym ołtarzu Sanktuarium.